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Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒
更新時(shí)間:2024-06-26
訪(fǎng)問(wèn)量:1108
廠(chǎng)商性質(zhì):代理商
生產(chǎn)地址:美國
Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒
包裝規格
產(chǎn)品貨號:An0020、An0050、An0100
規格:20T、50T、100T
儲存條件
4oC保存,一年有效
產(chǎn)品介紹:
磷脂酰絲氨酸(PS)是一種帶負電荷的磷脂,正常細胞中,PS只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內側,而在細胞凋亡早期,細胞膜 PS由脂膜內側翻向細胞膜外側,使PS暴露在細胞膜外表面。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+ 依賴(lài)性磷脂結合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,故可通過(guò)細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結 合。因此Annexin V被*為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。
Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒將Annexin V進(jìn)行綠色熒光(FITC)標記,以標記了的Annexin V作為探針,利用熒光顯微鏡或流式細胞儀 可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過(guò)正常細胞或早期凋亡細胞的完 整的細胞膜,但對凋亡中晚期的細胞和壞死細胞,PI能夠透過(guò)細胞膜而使細胞核染紅。因此采用Annexin V與PI雙染的方法,就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細胞區分開(kāi)來(lái)。
圖 1. 細胞凋亡過(guò)程中磷脂酰絲氨酸(PS)外翻示意圖
試劑盒組份:
所需實(shí)驗器材:
微量移液器;PBS;不含 EDTA 的胰酶消化液;低速離心機;流式細胞儀
注意事項:
1. 此試劑盒僅供研究使用。
2. 微量試劑需離心數秒將試劑收集至管底后再開(kāi)蓋取用。
3. Propidium Iodide(PI)有毒,操作時(shí)要帶手套,使用時(shí)避免與皮膚,眼睛和黏膜接觸。
4. Annexin V-FITC 中含有毒成分三氮化鈉(NaN3), 操作時(shí)要帶手套,使用時(shí)避免與皮膚,眼睛和黏膜接觸。
5. 本試劑盒用于檢測活細胞,流式細胞儀檢測時(shí),細胞數量不應低于 1x106。
6. 染色后宜盡快檢測,時(shí)間過(guò)長(cháng)可能會(huì )導致凋亡或壞死細胞的數量增加。
7. Annixin V 檢測凋亡細胞的方法適用于懸浮生長(cháng)的細胞,如:淋巴細胞等細胞的檢測。對于貼壁生長(cháng)的細胞,由于 在胰酶等消化處理過(guò)程中會(huì )造成細胞膜的損傷,會(huì )造成較高的假陽(yáng)性,而用細胞刮子會(huì )造成細胞粘連成團,而影響 檢測,可將胰酶消化后的細胞保存在含 2%BSA 的 PBS 中,防止進(jìn)一步的損傷。盡管目前,包括國外也有一些單 位采用該方法檢測貼壁生長(cháng)的細胞。我不推薦用該方法檢測。因為其重復性較差,且需要操作時(shí)非常小心。
8. 消化貼壁細胞殘留的胰酶會(huì )消化并降解 Annexin V-FITC,最終導致染色失敗。
9. 細胞固定后可能導致熒光的淬滅,請不要固定樣品。
操作說(shuō)明:
1. 細胞樣品的準備:
a) 懸浮細胞:
1)收集細胞至離心管中 1000-2000rpm 離心 5min,小心去除上清。
2)用 1ml 4℃預冷 PBS 輕輕重懸細胞并計數,1000-2000rpm 離心 5min,小心吸除上清。
3)再加入 1ml 4℃預冷的 PBS 重懸細胞,1000-2000rpm 離心 5min,小心吸除上清。
b) 貼壁細胞:
1)吸出細胞培養液至離心管中,PBS 洗滌貼壁細胞一次,加入適量不含 EDTA 的胰酶細胞消化液消化細胞。
2)室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來(lái)時(shí),吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過(guò)度消化。
3)加入以上步驟中收集的細胞培養液,稍混勻,轉移到離心管內,1000-2000rpm 離心 5min,小心吸除上清。 注:加入的細胞培養液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞,另一方面細胞培養液中的血清可 以有效抑制或中和殘留的胰酶;殘留的胰酶會(huì )消化并降解后續加入的 Annexin V-FITC 導致染色失敗。
4)用 1ml 4℃預冷 PBS 輕輕重懸細胞并計數,1000-2000rpm 離心 5min,小心吸除上清。
5)再加入 1ml 4℃預冷的 PBS 重懸細胞,1000-2000rpm 離心 5min,小心吸除上清。
2. 用去離子水按 1:4 稀釋 Binding Buffer(4ml Binding Buffer+12ml 去離子水);
3. 用 250?l 結合緩沖液重新懸浮細胞,調節其濃度為 1×106/ml;
4. 取 100?l 的細胞懸液于 5 ml 流式管中,加入 5?l Annexin V-FITC,輕輕混勻;
5. 室溫(20-25oC)避光孵育 10min;
6. 上機前 5min 加入 10?l 碘化丙啶溶液,輕輕混勻;
7. 上機前在反應管中補加 400?l PBS 重懸細胞, 避光保存,隨即進(jìn)行流式細胞儀(FACS)檢測, Annexin V-FITC 為綠色熒光,PI 為紅色熒光。
圖 2. 流式細胞儀檢測早期凋亡細胞。在雙變量流式細胞儀的散點(diǎn)圖上,左下象限顯示活細胞,右下象限為早期凋亡細胞,右上象限是凋亡晚期細胞和壞死細胞