小鼠胚胎MEF細胞的提取步驟：

1.將新鮮收獲的胚胎放入10厘米的細胞培養皿中

2.用PBSA覆蓋胚胎，取出胎盤(pán)和其他母體組織

3.切掉頭頂（眼睛及以上），取出內臟

4.保存頭部/卵黃囊進(jìn)行DNA分離以進(jìn)行基因分型檢測

5.將胚胎體置于單獨的10厘米板中

6.加入1mL胰蛋白酶，用刀片切碎成1mm的小碎片

7.用酒精燈火焰對樣品之間的刀片進(jìn)行消毒

8.將皿置于37°C培養箱中30-45分鐘（傾斜，使胰蛋白酶覆蓋細胞）

9.通過(guò)在每口井中添加4mL MEF培養基（通常DMEM+10%FBS+1%G/A）來(lái)抑制typsin活性。

10.用移液管10-20x吹打分離組織

11將細胞懸浮液轉移到T75燒瓶或10cm平板上，并添加6-15mL MEF培養基

12.讓細胞生長(cháng)融合（3-4天）

13.抽出培養基，用10mL PBS沖洗

14.加入3mL胰蛋白酶，在37°C培養箱中培養5-10min

15.加入7mL MEF培養基進(jìn)行中和

16.用移液管吸至離心管離心，使細胞重新懸浮

17.將懸浮液轉移到2個(gè)T175燒瓶中，并向每個(gè)培養瓶中添加50mL MEF培養基

18.讓細胞生長(cháng)融合（3-4天）

19通過(guò)胰蛋白酶消化收獲細胞，冷凍細胞@3x106細胞/瓶，注意冷凍不能密度太稀，此細胞凍存后復蘇的存活會(huì )大量減少。

備注：1.在細胞培養房中執行細胞分離，并注意無(wú)菌操作，

2. 建議使用含有血清的凍存液凍存。

3. 原代分離培養請使用慶大霉素/兩性霉素溶液來(lái)防止細胞污染發(fā)生。

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